Склероз

Маркеры нейродегенерации при рассеянном склерозе (клинико-биохимическое исследование) || Воробьева рассеянный склероз

Биомаркеры при РС

Методом МР-спектроскопии in vivo было обнаружено снижение количества N-ацетиласпартата в неизмененном на Т2 белом веществе, что подтверждает деструкцию аксонов вне очагов воспаления при РС [11, 57].

Методом оптической когерентной томографии сетчатки было показано, что при РС изменения аксонов сетчатки происходят даже при отсутствии анамнестических данных о перенесенном оптическом неврите.

Более того, было выявлено, что толщина волокон сетчатки коррелируют с тяжестью неврологического дефицита и данными МР-спектроскопии о степени диффузной дегенерации белого вещества головного мозга [11, 12].

Исследование аутоантител к белкам бета-амилоидов и цепям нейрофиламентов

Работа была выполнена по модели поперечного (одномоментного) исследования в параллельных группах пациентов. В исследование были включены 56 пациентов с достоверным диагнозом РС.

В зависимости от фазы заболевания (ремиссия или обострение) пациенты с РС были разделены на 2 подгруппы: 26 пациентов с ОРС и 30 с РРС.

Также в исследование были включены группа сравнения, 26 пациентов с БАС, и контрольная группа, 26 человек без неврологических заболеваний.

Была проанализирована сопоставимость групп по полу, возрасту и клиническим характеристикам

В ходе выполнения работы в образцах ЦСЖ и сыворотки крови пациентов методом твердофазного ИФА были количественно определены следующие протеины: ФНФТ, НФЛ, бета-амилоид 1-42 и бета-амилоид 1-42.

Также была предпринята попытка определить наличие аутоантител в ЦСЖ и сыворотке крови к тем же протеинам. 30% Вошедших в исследование пациентов с РС получали терапию ПИТРС первой линии (глатирамера ацетатом или интрефероном-бета).

воробьева рассеянный склероз

Нами было выяснено, что по клиническим характеристикам и уровню исследуемых маркеров пациенты, получавшие терапию, не отличались от тех, кто ПИТРС на момент включения в исследование не применяли.

В литературе освящено большое количество исследований, подтверждающих нейропротекторные свойства ПИТРС. Для бета-интерферона и глатирамера ацетата показано, что применении и в течение 1 года приводит к значимому снижению соотношения N-ацетиласпартата и креатинина по данным МР-спектроскопии [12, 33].

При многоцентровом исследовании финголимода, включившего 1033 пациентов, показано замедление изменения объема головного мозга по данным МРТ [95].

В биохимических же исследованиях ЦСЖ эффективными в отношении значимого изменения уровня маркеров нейродегенерации оказались натализумаб.

Применение натализумаба приводит к стойкому (сохраняющемуся даже в периоды обострения) снижению уровня НФЛ в ЦСЖ [85]. Позже было выявлено и снижение уровня ФНФТ при применении препарата в течение 1 года.

Надо отметить, что в последнем исследовании речь идет о ФНФТ «нормальной» степени фосфорилирования [104]. Что касается эффективности в отношении уровня бета-амилоидов, то здесь при применении натализумаба удалось выявить тенденцию к восстановлению уровня растворимых изоформ бета-амилоидов [34].

В нашем исследовании отличие пациентов, получавших ПИТРС, по уровню маркеров нейродегенерации не было выявлено ввиду малого числа пациентов и короткого периода применения ПИТРС.

При исследовании сыворотки крови методом твердофазного ИФА исследуемые протеины определены не были. В публикациях неоднократно ранее упоминалось о низком уровне амилоидов и нейрофиламентов в сыворотке крови.

Однако, учитывая крайнюю клиническую значимость разработки маркеров демиелинизирующих заболеваний содержащихся именно в легко доступных биологических жидкостях, необходимо усовершенствование методов с целью повышения их чувствительности.

В результате исследования была эффективно отработаны методики определения ФНФТ, НФЛ и бета-амилоидов 1-40 и 1-42 в ЦСЖ. ФНФТ были выбраны к исследованию, как наиболее широко изученный маркер аксональной деструкции.

НФЛ также являются структурным компонентом цитоскелета аксона, однако исследования по их количественному содержанию в биологических жидкостях пациентов крайне немногочисленны.

Белки, входящие в состав цитоскелета нейрона могут подвергаться воздействию ферментов. На С-конце НФС и НФТ в аксонах находятся повторы лизин-серин-пролин (высококонсервативные KSP – повторы), которые могут подвергаться фосфорилированию [31].

В норме фосфорилирование нейрофиламентов происходит в цитоплазме нерйона, в последующем фосфорилированные протеины транспортируются по аксону.

Признаком нарушения аксонального транспорта, а то есть и неродегенративного процесса, считается появление фосфорилированных нейрофиламентов в нейронах и их гиперфосфорилированных форм в цитоплазме клетки.

Степень фосфорилирования нейрофиламентов меняет презентируемые в их составе антигены, в связи с чем были разработаны антитела специфически связывающие нефосфорилированные, фосфорилированные и гиперфосфорилированные нейрофиламенты [147].

ФНФТ наиболее устойчивы к действию протеаз и, соответственно, могут быть более точно детектированы [146]. НФЛ не подвергаются фосфорилированию, так как в их цепи отсутствует С-конец богатый фосфорилирируемыми аминокислотными остатками.

Атипичный рассеянный склероз — концентрический склероз Бало: два ...

Нами были использованы наборы для детекции именно фософрилированных в «нормальной» степени нейрофиламентов.

При сравнении уровня ФНФТ в ЦСЖ исследуемых групп группы ОРС, РРС и БАС статистически значимо между собой не отличались. Контрольная же группа значимо отличалась от остальных групп: уровень ФНФТ в контрольной группе был ниже.

На основании этих данных справедливо предполагать, что аксонопатия на момент исследования имела место во всех трех исследуемых группах пациентов с неврологическими патологиями.

При чем, выраженность процесса нейродегенерации в этих трех группах была одинаковой. В предыдущих исследованиях уровня ФНФТ в группах пациентов с РС и БАС было показано, что уровень данного маркера при БАС оказывается выше, чем при РС [122, 164].

Отсутствие такого отличия между группами в нашем исследовании можно объяснить ранней стадией заболевания у большинства пациентов с БАС на момент выполнения люмбальной пункции.

В исследование были включены больные с достоверным диагнозом РРС согласно обновленным критериям McDonald 2010 [53]. В группу сравнения были включены пациенты с достоверным диагнозом БАС, установленным согласно Эль-Эскориальским критериям [49].

В контрольную группу были включены пациенты с хирургической патологией, которым проводилась спинальная анестезия, без соматической и неврологической патологии.

В группу ремиссии РРС были включены пациенты стабильные по неврологическому статусу более 30 дней. Неврологический дефицит пациентов с РС был оценен по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale), 10-бальной шкале тяжести состояния при РС [107], подробнее описанной в Приложении 1.

Нарушение когнитивных функций, а именно самый распространенный его вариант при РС, снижение скорости обработки информации, оценивалось с помощью теста PASAT (paced auditory serial addition test, пошаговый аудиотест на серийное сложение чисел) [29].

Лаборатория биокатализа ИБХ: дизайнерские ферменты и клоны-мятежники

Подробное описание теста представлено в Приложении 2 [83, 154].

Диагноз БАС ставился согласно пересмотренным критериям El Escorial [49] с применением электромиографического алгоритма [53]. Оценка функционального состояния пациентов c БАС была выполнена по шкале ALS FRS-R (revised ALS functional rating scale).

, подробнее описанной в Приложении 3.

Статистически значимо группы не отличались друг от друга по половому составу и продолжительности заболевания. По возрасту группа БАС отличалась от групп ОРС и РРС, однако зависимости исследуемых параметров от возраста ни в одной из групп выявлено не было, в связи с чем сравнение этих групп можно считать допустимым и оправданным.

По клиническим характеристикам данные 4 пациента от остальных больных в группе РРС ничем не отличались.

Пациентов с РС (9 пациентов с ОРС и 7 пациентов с РРС) к моменту проведения исследования получали иммуномодулирующую терапию препаратами первой линии (глатирамера ацетат или интерферон — бета).

Средняя продолжительность терапии составила 6 месяцев в случае глатирамера ацетата и 4 месяца в случае препаратов интерферона-бета.

По клиническим характеристикам пациенты, получавшие ПИТРС, не отличались от остальных.

Пациенты, получавшие терапию цитостатическими препаратами или иммуномодулирующими препаратами второй линии (финголимод, натализумаб) в исследование не включались.

На момент выполнения исследования на стадии генерализации (появление клинических или ЭНМГ признаков поражения мотонейронов на трех уровнях: бульбарном, шейном, поясничном) заболевание было у 18 пациентов.

Из них у 12 был быстрый темп развития заболевания (генерализация заболевания по клиническим данным или данным ЭНМГ в течение первого года заболевания).

Продолжительность заболевания пациентов с БАС составила 14,5 [10; 24]. Характеристика неврологического дефицита пациентов с БАС по шкале ALS-FRS-R представлена в таблице 7.

Забор и подготовка биологического материала

Определение бета-амилоид 1-40 1. Размораживание, перемешивание, разведение образцов ЦСЖ и стандартных разведений 2.

Подготовка 96-луночной плашки, покрытой антителами к NH2-концу белка бета-амилоид 1-40 3. Нанесение вторичных антител, антитела к бета-амилоиду 1-40 человека, по 50мкл в ячейки плашки 4.

Нанесение образцов и стандартных разведений по 50мкл в ячейки плашки 5. Инкубация при температуре 4С на шейкере в течение 16-20 часов 6.

Промывка плашки с помощью вошера Lisa-Wash по 300мкл 5 раз 0,05% раствором полисорбционного сурфактанта Твин 20 в натрий фосфатном буфере pH 7,4 7.

Нанесение третичных антител, конъюгированные с пероксидазой антитела к антителам кролика, по 100мкл в ячейки плашки 8. Инкубация при комнатной температуре на шейкере в течение 30 минут 9.

Промывка плашки аналогично пункту 6. 10.

Нанесение раствора 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидина по по 100мкл в ячейки плашки 11. Инкубация 5-30 мин до появления голубой окраски в ячейках 12.

Нанесение стоп-реагента 2N H2SO4 по 50мкл в ячейки плашки 13. Помещение плашки в ридер, определения оптической плотности при длине волны 450нм Все измерения образцов проводили в двух параллельных пробах, калибровочную кривую строили по измерениям в трех параллельных пробах.

Все измерения образцов проводились в двух параллельных пробах, для каждой пробы также были выполнены два отрицательных контроля (ячейки без исследуемого антигена, в остальном полностью идентичные пробам): 1.

Инкубация антигена производителя Bachem, Швейцария, в бикарбонатном буфере pH 5,0 в течение 16 часов при температуре 4оС 2. Промывка 0,05% раствором полисорбционного сурфактанта Твин 20 в натрий фосфатном буфере pH 7,4 3.

Инкубация c блокирующим раствором, 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в натрий фосфатном буфере pH 7,4 4. Промывка 0,05% раствором полисорбционного сурфактанта Твин 20 в натрий фосфатном буфере pH 7,4 5.

Инкубация с ЦСЖ или сывороткой в разведении (нами были отработаны разведения от 1.100 до 1.10 для ЦСЖ и от 1.1000 до 1.100 для сыворотки) 6.

Промывка 0,05% раствором полисорбционного сурфактанта Твин 20 в натрий фосфатном буфере pH 7,4 7. Инкубация с вторичными антивидовыми мечеными пероксидазой антителами, конъюгат к IgG человека козы с пероксидазой, производство Sigma, США.

Разведение в 1% растворе БСА с добавлением Твин-20 (0,05 %) в разведении 1 к 10000 в течение 30 минут при 37o C (100 мкл на каждую ячейку) 8.

Промывка 0,05% раствором полисорбционного сурфактанта Твин 20 в натрий фосфатном буфере pH 7,4 9. Детекция с использованием дигидрохлорида O-ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/мл в 0,05 М фосфат-цитратном буфере с добавлением пероксида водорода в концентрации 0,25 мкл/мл (по 100 мкл в каждую ячейку), в темноте при комнатной температуре.

После остановки реакции серной кислотой фотометрическая детекция проводилась на длине волны 490 нм, 1 с, на мультифокальном плашечном ридере (Perkin Elmer).

Уровень альбумина в ЦСЖ и сыворотке крови пациентов определялся на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30I praim методом колориметрии после добавления бромкрезола зеленого.

Клинико-иммунологическая эффективность иммуномодулятора Галавит ...

Статистическая обработка результатов

Количественные переменные описывали следующими параметрами: числом пациентов, медианой (М), 25-ым и 75-ым процентилями (M [Q1;Q2] ).

Для сравнения двух групп по количественному признаку применяли критерий Манна-Уитни при уровне значимости 0.05 с поправкой Бонферрони, для множественного сравнении — критерий Крускалла-Уоллиса.

Для выявления корреляции данных был использован тест ранговой корреляции Спирмена. Такое относительное выражение уровня детектируемого методом ИФА вещества позволяет с большей точностью сравнивать результаты экспериментов, проведенных не одновременно [7, 36, 37, 199, 200].

Расчет выполнен на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel 2003 и пакета статистического анализа данных Statistica 8.

0 for Windows (StatSoft Inc. USA).


Для проведения ROC-анализа использовался он-лайн калькулятор «SimpleROCCurveAnalysis».

Adblock
detector